刘震助教商讨组织在单细胞分析及活体分析方面得到关键进展,陈兴课题组在化学糖生物学领域获得进展

2016年9月16日,化学领域国际顶级期刊德国《应用化学》在线发表了我校刘震教授研究团队提交的题为“Probing
low-copy-number proteins in a single living cell”的论文(Angew. Chem.
Int. Ed., 2016, DOI: 10.1002/anie.201608237)。

聚糖作为组成细胞的生物大分子之一,参与调控许多重要的生理和病理过程。相对核酸和蛋白质而言,聚糖具有结构复杂、形式多样等特点,因而对其功能的解析极具挑战性。近年来,化学与糖生物学的交叉研究快速发展,为聚糖的合成、分析和调控提供了新的有力途径。

神经节苷脂是细胞表面糖链的一种重要分子形态,包含一个或多个唾液酸末端寡糖链,通过神经酰胺部分的烷烃链嵌在细胞膜上,在高特异性酶作用下增减糖单元,动态地在细胞表面合成和降解,调节细胞结构、细胞粘附和信号传导,并作为微生物毒素、细菌和病毒的受体,与细胞生命过程密切相关。神经节苷脂异常的糖基化通路与遗传性疾病、肿瘤组织恶性转化等疾病相关。不同亚型的神经节苷脂异常过表达还与肿瘤的类型和进程密切相关。因此,筛查细胞表面的神经节苷脂对揭示其相关的生物过程和潜在的肿瘤进程具有重要的意义。

单细胞分析技术是揭示细胞的行为、功能及微观不均一性的核心工具。低拷贝数蛋白质(单个细胞中含量低于1000个分子的蛋白质)在细胞信号和基因表达调控等细胞功能中起到重要的作用。尽管已有多个单细胞技术(如毛细管电泳、质谱和微流控芯片等)用于分析单细胞内蛋白质的表达,但由于灵敏度低的原因这些方法通常仅适用于高表达的蛋白质。另一方面,单细胞活体分析在发育生物学和细胞质量控制分析等方面具有重要意义。但是,很多单细胞分析技术需要向细胞内引入标记试剂,改变了细胞内的化学组成。该研究团队提出了基于活体微萃取和表面等离激元光学检测相结合的,称为“表面等离激元免疫夹心法”的新颖方法,可以检测单个活细胞和活体动物中的低拷贝数蛋白。该方法的原理为,将表面修饰了单克隆抗体或分子印迹聚合物的金基微萃取探针在显微操作平台的辅助下插入到单细胞中,在很短的时间内将特定的目标蛋白质专一高效地萃取到探针表面,微萃取探针拔出并经清洗后用修饰了能识别目标蛋白质的抗体或硼亲和配基的银基纳米拉曼探针标记,从而形成萃取探针-目标蛋白质-拉曼标签三明治型复合物结构,当用激光束照射以上三明治型复合物表面时发生表面等离激元光学效应,银基拉曼标签产生表面增强拉曼散射,金基微萃取探针产生表面等离子波则进一步增强银基拉曼标签的表面增强拉曼散射信号,从而大大增强检测灵敏度,检测限可达单分子水平。微萃取的尺寸极小,活体萃取过程对细胞的损伤很小,萃取后细胞仍存活。利用该方法,实验揭示,碱性磷酸酶和survivin在正常细胞内不表达或有限表达,而在癌细胞中为高表达;而且,癌细胞过度的传代会导致survivin的表达降低。此外,该研究团队还将该分析技术赋予了中国文化元素,利用针灸针制备出微萃取探针,用于活体动物组织内的低拷贝数蛋白质的测定。该单细胞分析技术在癌症诊断与预后、细胞质量控制、发育生物学、干细胞研究及脑科学等多个领域中具有重要的应用前景。

北京大学化学与分子工程学院的陈兴课题组致力于开发化学标记策略和成像手段,在活细胞和活体水平上揭示糖基化的生物学功能及其分子机理。这是化学糖生物学领域中很受关注的研究方向。在前期研究工作中陈兴课题组发展了一种具有细胞选择性的聚糖标记技术,实现了对癌症细胞表面聚糖的靶向性标记成像和富集鉴定(J.Am.Chem.Soc.2012,134,9914)。基于这些工作基础,他们最近在标记探针和成像技术上做了进一步的探索,取得了重要进展。

我校生命分析化学国家重点实验室的鞠熀先教授课题组从事细胞表面糖链研究已经十年,在细胞表面糖基的原位检测方法学研究领域提出了奠基性的成果(J.
Am. Chem. Soc. 2008, 130, 7224;Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6465;
Anal. Chem. 2010, 82, 5804; Anal. Chem. 2012, 84, 1452;Chem. Sci. 2015,
6, 3769)。近两年该研究组发展了特定蛋白质上糖基的多种原位检测方法(Chem.
Sci. 2016, 7, 569,Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 5220; Angew. Chem.
Int. Ed. 2017, 56,
8139)。近期,他们针对神经节苷脂研究的迫切需求,设计了一对具有非破坏性提取和疏水收集功能的浮力微球探针,实现了细胞表面神经节苷脂的定量、亚型筛查与再生分析,于2017年12月4日在线发表(Angew.
Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie. 201710984)。

该论文的第一作者为博士生刘佳同学。在研究工作中,该团队前期建立起的分子印迹技术(Angew.
Chem. Int. Ed., 2013, 52, 7451-7454; 2014, 53, 10386-10389; 2015, 54,
10211-10215; Chem. Sci., 2014, 2014, 5,
1135-1140)经受住了挑战性任务的考验。陈洪渊院士课题组为该研究工作提供了重要的技术支持。该研究得到国家杰出青年科学基金、国家重大科研仪器研制项目和国家重大科学研究计划的经费支持。

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该研究工作由助理研究员陈云龙为第一作者,鞠熀先教授为通讯作者于10月25日投稿,11月13日预录用。他们构建的一对功能化浮力微球包括提取探针和收集探针。提取探针以马来酰亚胺修饰的二氧化硅浮力微球为基底,在其上共价结合具有核酸内切酶切割位点和硼酸末端的DNA分子,通过硼酸与细胞表面唾液酸的共价识别作用,将细胞表面包含唾液酸的生物分子通过浮力提取。在核酸内切酶的作用下,被提取的生物分子被释放到溶液中,并由十八烷硅烷化的收集探针通过疏水作用收集其中的结合有核酸碎片的神经节苷脂,进一步利用体外杂交链反应对神经节苷脂进行荧光定量。用唾液酸剪切酶切除收集探针上收集的神经节苷脂中的唾液酸残基,通过荧光标记的凝集素识别残留聚糖,该工作发展了细胞表面神经节苷脂亚型的筛选鉴定方法,并第一次提出三种神经节苷脂亚型。利用提取探针对细胞表面唾液酸包含物进行不同程度地提取,可用这两种探针对细胞表面神经节苷脂的再生过程进行监测。与已有的神经节苷脂分析方法相比,该方法无需细胞破碎及其它预处理,首次实现了细胞表面神经节苷脂的定量筛查、亚类鉴定和再生分析,为揭示神经节苷脂相关的生命过程提供了重要工具。

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在最近发表于J.Am.Chem.Soc.(DOI:10.1021/ja402326z)的一项工作中,陈兴课题组开发了一种新型的双功能非天然唾液酸探针,用于研究唾液酸化聚糖与其结合蛋白质的相互作用。唾液酸是组成细胞表面聚糖的重要单糖分子之一,通常位于聚糖的最外端。含有唾液酸的聚糖分子在细胞迁移、病原体与宿主相互作用等过程中扮演了非常重要的作用,这些功能的发挥都依赖于唾液酸与其结合蛋白的相互识别和作用。为了对唾液酸结合蛋白进行高通量的捕获和研究,他们设计合成了同时含有两种功能基团的唾液酸类似物,并验证了这些双功能唾液酸探针可以被细胞代谢,用于唾液酸化聚糖的代谢标记。当功能基团为两种生物正交反应基团时,这种双功能唾液酸可以被用于聚糖的多色成像和细胞表面糖蛋白周转的动态检测。当双功能唾液酸同时含有生物正交反应基团和光交联基团时,可用于进行唾液酸结合蛋白的捕获、富集和鉴定。该工作与北大生科院谢灿课题组和深圳研究生院赵劲课题组合作完成。

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图1. 表面等离激元免疫夹心法的单细胞分析原理示意图

目前针对聚糖的成像手段通常需要利用生物正交反应对聚糖进行荧光标记。但由于生物正交反应必须满足十分严苛的要求,只有少数几种化学反应符合“生物正交”的条件。陈兴课题组提出了“生物正交拉曼标记”的概念,结合拉曼成像技术,实现对聚糖的直接标记与成像,从而无需使用生物正交反应。他们设计并合成了含有“生物正交拉曼基团”的非天然糖探针。“生物正交拉曼基团”定义为该基团的拉曼振动信号落在细胞的“拉曼静默区间”,即细胞中的天然生物分子在此期间无拉曼信号。运用这些非天然糖和表面增强技术,他们实现了细胞表面唾液酸化聚糖的直接拉曼检测和成像。聚糖的拉曼检测方法有望与荧光技术互补,用于研究一系列不同的糖基化过程。该成果最近发表于Angew.Chem.Int.Ed.(DOI:10.1002/anie.201301387),并被评选为当期的内封面。这项工作与厦门大学化学学院的田中群课题组合作完成。

图1. 功能浮力微球探针的制备和细胞表面神经节苷脂定量分析原理

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以上工作均得到了自然科学基金委员会和科技部的经费支持。

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图2.
单细胞活体微萃取示意图、单细胞内碱性磷酸酶的空间分布、单细胞分析结果和细胞裂解液分析结果比较、检测正常肝细胞内6个survivin分子所得拉曼信号及不同细胞系中碱性磷酸酶及survivin的分析结果对照

个人简介:

图2. 细胞表面神经节苷脂亚型的鉴定原理和分析结果

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陈兴,2010年9月加入北京大学化学与分子工程学院,任“百人计划”研究员,从事化学生物学研究和教学工作。2011年5月入选北大−清华生命科学研究中心PI。目前的研究兴趣主要集中于化学糖生物学领域。近期获DuPontYoungProfessorAward和SCOPUS青年科学之星等奖项。

(化学化工学院 科学技术处)

图3.
基于针灸针萃取探针的表面等离激元免疫夹心法检测种植了不同细胞的小鼠内碱性磷酸酶及survivin

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(化学化工学院 科学技术处)

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